Optimering af praktiske PCR-maskiner i realtid

Hvis det er realtidsfluorescens-kvantitativ PCR til viruskvantificering og SNP-genotype, har vi brug for en PCR-maskine med den højest mulige specificitet; Hvis det er patogen- og mRNA -detektion, har vi brug for PCR -maskine med høj følsomhed , så hvordan skal vi optimere denne PCR -maskine?

Her er indholdslisten:

l Forbedring af PCR -maskineforstærkningseffektivitet

l ved hjælp af realtids PCR-maskinprimere til generel PCR

Forbedring af PCR -maskineforstærkningseffektivitet

For at forbedre PCR- maskinforstærkningseffektiviteten, specificiteten og følsomheden kan vi optimere kvantitativ PCR-maskine i realtid til eksperimentet gennem en række mål. Den første er valget af målsekvensen.

1, Valget af praktisk realtid PCR-maskine målsekvens passende længde mellem 50 til 150bp. Kortere sekvenser tager mindre tid at syntetisere og have kortere amplifikationstider, så muligheden for at kontaminerende DNA bliver amplificeret reduceres.

2, når du vælger målsekvensen, skal du bruge BLAST -søgning til at analysere målsekvensen for polymorfismer og sekventeringsfejl og undgå dem. Hvis der er duplikatsekvenser i målsekvensen, reducerer den detektionsfølsomheden af denne PCR -maskine og bør også undgås.

3, kontroller GC -indholdet ≤ 60% i målsekvensen. Højt GC-indhold vil påvirke denatureringen af målsekvensen i den termiske cyklus, men også let at fremstille denne PCR-maskine ikke-specifikke amplifikation.

4, undgå at generere sekundær struktur. Målsekvenser med omvendte gentagne sekvenser er lette at fremstille sekundær struktur, hvilket påvirker hybridiseringen af praktisk realtid PCR-maskinprimere og sonder.

Derudover er vi også nødt til at sikre, at kvaliteten af skabelonen ikke påvirker amplificeringen, resultaterne af den praktiske PCR-maskine i realtid har pålidelighed. For eksempel kan beskadiget DNA ikke forstærkes tilstrækkeligt i PCR -maskinen eller overhovedet ikke forstærket. Tilstedeværelsen af DNA -polymeraseinhibering af reagenser (DMSO osv.) Og forurenende stoffer (SDS osv.) I skabelonen kan påvirke pålideligheden af PCR -maskinforstærkningsresultaterne.

Brug af PCR-maskinprimere i realtid til generel PCR

Få praktisk realtid PCR-maskinprimere , denne metode kan også bruges til almindelig PCR.

1, længden skal være 18-30bp for at sikre bindende specificitet.

2, smeltetemperaturen (TM-værdi) skal være 55-60 ° C, og TM-værdierne for de to primere skal variere med 2-3 ° C.

3, hver primer skal have 1 til 3 guaniner eller cytosiner ved 3 'enden, hvilket nemt kan reducere den ikke-specifikke amplifikation under PCR-maskinen i realtid. Mere end 3 vil slå tilbage og forårsage en 'glidende effekt ', der fører til den forkerte udvidelse.

4. GC -indholdet af primerne skal være omkring 50%, for højt GC -indhold vil øge TM -værdien.

5, PCR -maskinprimere bør undgå omvendte gentagne sekvenser, fordi den vil danne en sekundær struktur, der påvirker primerbindingen på skabelonen.

6, hvis det er RT-PCR, skal du også undgå at designe primere til at binde på exonsekvenser, hvilket vil føre til falsk-positive PCR-maskine-eksperimentelle resultater. Den korrekte tilgang skal designes på den lange intron-flanke eller korte introner eller på tværs af exon-exon-krydsetregionen.

7. Desalting og rensning af primere.

Bemærk, at når du har gjort alle punkterne, kan primerne muligvis ikke forstærke, så du skal redesigne primerne.

Med fokus på hurtig nukleinsyretektion og POCT Rapid Detection, Bioteke tilbyder slags labinstrumenter som: virusprøvetagningskollektion, automatisk nukleinsyreekstraktor, PCR -maskine og desinficeringsapparat. Og det giver også mange slags reagenser og sæt.